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外泌體是一類細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡 (EVs) ，直徑約40~160 nm，它們攜帶核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物，是細(xì)胞間的通訊介質(zhì)，影響細(xì)胞生物學(xué)的各個(gè)方面。人體幾乎所有類型的細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，外泌體廣泛分布在如血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等。
由于外泌體等EVs具有高生物利用度、生物穩(wěn)定性、靶向特異性、低毒性和低免疫原性，其在疾病診斷、治療及藥物遞送中潛力。Biacore作為分子互作“金標(biāo)準(zhǔn)”，研究EVs當(dāng)然也離不開ta。
免疫檢查點(diǎn)療法通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞中的免疫檢查點(diǎn)信號(hào)通路來增強(qiáng)抗癌免疫應(yīng)答，取得了重要的臨床進(jìn)展，然而由于免疫衰竭，超過一半的癌癥患者對(duì)這種治療沒有反應(yīng)。北京大學(xué)呂萬良教授團(tuán)隊(duì)針對(duì)腫瘤免疫檢查點(diǎn)治療中免疫衰竭與免疫逃逸的問題，重組構(gòu)建了一種基因工程外泌體PD1 - Imi Exo，用于逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫治療中的T細(xì)胞衰竭。相關(guān)研究于今年初在線發(fā)表在Bioactive Materials雜志[2]。
圖1：工程化外泌體PD1 - Imi Exo研究路線及作用機(jī)制
PD1- Imi Exo通過基因工程設(shè)計(jì)PD1，同時(shí)包裹一種免疫佐劑Imiquimod，可以首先阻斷CD8+ T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，表現(xiàn)出PD1/PDL1免疫檢查點(diǎn)阻斷作用，并通過釋放Imiquimod促進(jìn)未成熟樹突狀細(xì)胞成熟，激活和恢復(fù)CD8+ T細(xì)胞的功能，逆轉(zhuǎn)免疫衰竭（圖1）。 為了驗(yàn)證PD1 Exo與PDL1的直接結(jié)合，作者使用Biacore分別測(cè)定了PDL1與PD1蛋白及與PD1 Exo的結(jié)合（圖2）。作者首先將PDL1蛋白偶聯(lián)在CM5芯片上，PD1蛋白或PD1 Exo作為分析物，測(cè)定結(jié)合變化。結(jié)果表明，相較于PD1蛋白，PD1 Exo與PDL1的親和力提高了數(shù)百倍。而除了親和力信息外，Biacore實(shí)時(shí)檢測(cè)的特點(diǎn)可以獲得二者的結(jié)合速率和解離速率信息，相較于PD1蛋白，PD1 Exo與PDL1的解離明顯變慢，說明其與PDL1的結(jié)合更加穩(wěn)定，預(yù)示著其可能具有較長的藥效。
圖2：Biacore檢測(cè)PDL1與PD1蛋白 (G) 與PD1 Exo (H) 的結(jié)合
文中實(shí)驗(yàn)還表明，PD1 - Imi Exo呈水泡狀圓形（約139 nm），對(duì)腫瘤細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞均有明顯的靶向作用和較強(qiáng)的結(jié)合作用，對(duì)黑色素瘤小鼠和乳腺癌小鼠均有顯著的治療效果。本研究也為提高PD1/PDL1的治療效果，通過重建患者的免疫功能來預(yù)防術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，從而鞏固整體預(yù)后提供了一種有希望的新策略。
除了通過基因工程化改造外，胞外對(duì)已分離的細(xì)胞外囊泡 (EV) 表面進(jìn)行工程化改造的方法不受細(xì)胞活性影響，還可以引入非天然的分子。意大利布雷西亞大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)2023年在Nanoscale Advances發(fā)表的封面文章中，分別利用物理吸附與化學(xué)吸附（利用點(diǎn)擊化學(xué)共價(jià)結(jié)合）兩種方法將Cetuximab (CTX) 修飾在Red blood cell EV表面，并使用Biacore檢測(cè)兩種方法制備的REV與靶點(diǎn)EGFR結(jié)合的差異[3]。
圖3：抗體EV組裝方法示意圖
作者使用Biacore X100，將EGFR偶聯(lián)在CM5芯片上，分別檢測(cè)了EGFR與EGF、CTX、mCTX (modfied CTX) 、天然REVs、四種工程化REVs的親和力。EGF、CTX與EGFR的親和力均與文獻(xiàn)報(bào)道相符 (67.3nM、1.8nM) ，而化學(xué)修飾則使CTX的親和力降低，mCTX親和力為3.6nM。在檢測(cè)EGFR與外泌體的結(jié)合時(shí)，首先天然的REVs未觀察到結(jié)合信號(hào)，化學(xué)吸附的REVs-click-mCTX的親和力為0.17nM，高于mCTX十倍，且呈現(xiàn)典型的慢解離過程，物理吸附的外泌體REVs-physi-mCTX親和力與REVs-click-mCTX相當(dāng)。
圖4：Biacore X100檢測(cè)EGFR與蛋白或REVs的親和力
此外，作者還發(fā)現(xiàn)，同一張EGFR芯片檢測(cè)中，REVs-click-mCTX的飽和結(jié)合信號(hào)Rmax比REVs-physi-mCTX高4倍，推測(cè)可能時(shí)由于物理吸附較弱，當(dāng)mCTX與芯片表面的EGFR結(jié)合更強(qiáng)時(shí)，mCTX從REVs上脫落下來，牢牢地結(jié)合在芯片表面地EGFR上，并與REVs-physi-mCTX競(jìng)爭性結(jié)合EGFR，最終導(dǎo)致芯片表面的最大結(jié)合量Rmax降低。而工程化的REVs-mCTX穩(wěn)定性可能對(duì)體外囊泡攝取及其實(shí)際治療應(yīng)用具有重要意義，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)REVs-click-mCTX對(duì)靶細(xì)胞表現(xiàn)出更好的結(jié)合和攝取能力。
外泌體廣泛分布在血液與體液等液態(tài)標(biāo)本中，通過檢測(cè)其內(nèi)容物或表面生物標(biāo)志物等，可以進(jìn)行精準(zhǔn)的疾病診斷。錫耶納大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞在常氧和缺氧條件下都釋放小細(xì)胞外囊泡sEV，但只有缺氧誘導(dǎo)的sEV表達(dá)CA-IX mRNA和CA-IX蛋白，據(jù)此開發(fā)一種ELISA檢測(cè)方法，相關(guān)成果于2023年發(fā)表在International Journal Of Molecular Sciences[4]。 缺氧處理HEK293pRTS-CA9 cells獲得sEVs后，為了鑒定其表面是否有CA-IX蛋白，作者使用Biacore分別檢測(cè)了anti-CA-IX 抗體與CA-IX蛋白及sEVs的結(jié)合，確定了sEVs表面的CA-IX蛋白。
圖5：Biacore檢測(cè)anti-CA-IX抗體與CA-IX蛋白及sEVs的結(jié)合
外泌體等細(xì)胞外囊泡的功能研究，及其在在治療、診斷領(lǐng)域的開發(fā)愈加火熱，持續(xù)的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)進(jìn)展將會(huì)揭示更多其異質(zhì)性和生物學(xué)功能的信息，促進(jìn)其用于治療和診斷疾病。Biacore作為高靈敏、高精準(zhǔn)的分子互作技術(shù)，可以為各類型分子間的相互作用提供高質(zhì)量的結(jié)合動(dòng)力學(xué)、親和力、濃度等數(shù)據(jù)，期待與廣大用戶共同發(fā)現(xiàn)更多新療法，新應(yīng)用。
